| Qu'est
ce qu'un animal transgénique ?
Un
animal transgénique est un animal porteur d'ADN
exogène (un ou plusieurs gènes) intégré
dans son propre génome.
Dans
le cadre de la production de protéines ou de
vaccins recombinants utilisés en santé
humaine, cet ADN code une protéine hétérologue
d'intérêt thérapeutique (anticorps,
hormone, protéine de capside virale...), qui
est secrétée dans le lait des animaux
transgéniques puis purifiée. Les
animaux transgéniques sont devenus aujourd'hui
un système de production efficace pour fournir
de grandes quantités de
protéines
thérapeutiques ou
de vaccins recombinants,
à des coûts très compétitifs.
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Pourquoi
choisir le lait d'animaux transgéniques pour
produire des protéines ou des vaccins recombinants
?
La
glande mammaire est un organe qui produit naturellement
de grandes quantités de glycoprotéines
complexes (en moyenne 140 g de protéines totales
par litre de lait chez le lapin). Ces protéines
assurent principalement un rôle nutritif pour
les nouveaux nés.
Les
cellules épithéliales de la glande mammaire
possèdent la machinerie cellulaire nécessaire
à la synthèse, au repliement et à
l'assemblage de glycoprotéines complexes. Elles
peuvent notamment réaliser des modifications
post-traductionnelles telles que les glycosylations
ou les gamma-carboxylations.
Pour de nombreuses protéines
recombinantes d'origine humaine, ces modifications post
traductionnelles sont indispensables pour garantir une
activité biologique et des caractéristiques
pharmacocinétiques appropriées.
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Quels
sont les avantages des systèmes d'expression
transgénique par rapport aux autres systèmes
?
Diverses
méthodes sont utilisées pour la production
industrielle de protéines:
Les systèmes bactériens
(E. Coli) sont très utilisés
et efficaces. Ils permettent de produire des protéines
à faible coût. Cependant, leur utilisation
est limitée à la production de protéines
simples, non glycosylées, qui ne requièrent
pas de processus élaboré de repliement.
La purification des produits restent souvent difficile
à mettre en oeuvre.
Les systèmes fongiques permettent
de produire certaines protéines secrétées.
Néanmoins, ces systèmes apportent des
modifications post-traductionnelles qui affectent fortement
les propriétés pharmacocinétiques
des protéines produites (ajout de divers groupements
mannose).
Les systèmes utilisant des baculovirus
permettent de produire des protéines
très variées mais leur application à
l’échelle industrielle reste difficile.
La culture de cellules de mammifères
est le système standard de production de protéines
recombinantes complexes (telles que les anticorps monoclonaux).
Les systèmes d’expression cellulaire permettent
d’obtenir des protéines recombinantes correctement
repliées et modifiées. Cependant les coûts
élevés d'investissement et de production
restent les inconvénients majeurs de cette technologie.
Les systèmes utilisant des plantes transgéniques
permettent de produire des protéines en quantités
très importantes. Cependant, ces systèmes
apportent des modifications post-traductionnelles spécifiques
aux plantes (ajout de résidus xylose), fortement
immunogènes pour des patients humains, faisant
de cette technologie une technologie prometteuse à
long terme mais industriellement inexploitable à
court/moyen terme.
Les animaux transgéniques
représentent une excellente solution alternative
pour produire des vaccins recombinants ou des protéines
thérapeutiques complexes, correctement glycosylées
et repliées. Ils permettent de combiner à
la fois les niveaux d’expression
élevés obtenus en fermentation bactérienne
et les modifications post-traductionnelles
proches de l'homme, tout en offrant des coûts
de production plus faibles que les systèmes d’expression
cellulaires.
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Pourquoi le lapin ?
En raison de ses capacités à générer
un grand nombre de fondateurs grâce au faible
coût de revient des embryons. Cela fournit
à nos clients l'opportunité d'augmenter
significativement les chances d'obtenir une ou plusieurs
lignées de lapines transgéniques produisant
des quantités suffisante d'une protéine
biologiquement active.
Le lapin est une espèce animale qui peut être
élevée et exploitée dans un statut
sanitaire contrôlé (SPF - Specific
Pathogen Free ou EOPS en français - Exempt d'Organismes
Pathogènes Spécifiques) offrant
plus de garanties pour une production biopharmaceutique.
Période de gestation courte et maturation sexuelle
rapide, permettant d'évaluer rapidement l'efficacité
du bioréacteur dans un projet donné, et
d'offrir un court délai
de mise sur le marché.
--> En savoir plus…
Les lapins sont phylogéniquement plus
proches de l'homme que d'autres mammifères
notamment les ruminants (Vaches, chèvre, brebis)
et les rongeurs (Hamsters). La glande mammaire des lapines
offre ainsi des capacités de modifications
post traductionelles supérieures aux
autres espèces, faisant du lapin un modèle
de choix pour la bioproduction de glycoprotéines
complexes à usage thérapeutique humain.
En particulier, la glande mammaire des lapines est connue
pour hypo-fucosyler
les protéines qu'elle sécrète,
ce qui présente un intérêt pour
la production d'anticorps monoclonaux à mécanisme
d'action ADCC. La glande mammaire des lapines réalise
des sialilations avec un mélange
de formes NANA (N-Acétyl Neuraminic
Acid) et NGNA
(N-Glucolyl Neurmaninic Acid). Alors que les protéines
humaines sont naturellement NANA sialilées, la
plupart des lignées CHO utilisées en bioproduction
génèrent des protéines hautement
fucosylées et avec 100% de formes NGNA sialilées.
Faibles coûts de production : jusqu’à
50% d’économie en comparaison avec le système
de référence de l’industrie (cellules
CHO).
La majorité des protéines à usage
thérapeutique actuellement sur le marché
ont des indications qui nécessitent une production
mondiale annuelle inférieure à 10 Kg de
protéines. Dans ce contexte, le lapin
apparait comme un système particulièrement
adapté et
flexible.
Adapté à la production de protéines
complexes et glycosylées.
Pas de maladie à
prion connue chez le lapin.
Pas de transmission de maladies virales sérieuse
à l’homme
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Quel
volume de lait et quelle quantité de protéines/vaccins
recombinants un lapin peut-t-il produire ?
Une femelle peut produire jusqu’à
250 ml de lait par
jour de lactation. Cependant,
seuls 100 à 150 ml de lait sont collectés
en routine par animal et par jour de lactation.
Le volume de lait collecté par femelle
atteint ainsi jusqu'à
15 litres par an.
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Davies
(1983) The composition of milk. Biochem. Lactation,T.B.Mepham.
Elsevier, 71-117.
Jenness (1982) Inter-species comparison of milk
proteins. Dev Diary Chemistry, 1:87-114. |
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La concentration en protéines recombinantes
présentes dans le lait est variable selon
la lignée de lapines transgéniques
obtenues. Elle est comprise en moyenne entre
0.1
à 10 g par
litre de lait.
Grâce
à sa plate-forme technologique, BioProtein
Technologies peut offrir une production
efficace jusqu'à
quelques dizaines de kg de protéines
ou de vaccins recombinants
par an.
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| Comment
récupère-t-on le lait ?
Les lapines sont traites mécaniquement
dans une salle de traite confinée. Le lapin
fournit entre 10 à 15 litres de lait par
femelle et par an.
BioProtein
Technologies a mis au point, en collaboration
avec l’INRA, une trayeuse automatique
qui permet de collecter efficacement le lait de
chaque lapine. Ces trayeuses sont en fonctionnement
depuis quelques années et ont d’ores
et déjà prouvé leur efficacité.
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Quels
types de composés biopharmaceutiques peut-on
produire ?
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Protéines Plasmatiques
- Anticorps Monoclonaux
- Hormones
-
Peptides
- Vaccins recombinants
Depuis
une quinzaine d'années, les équipes INRA
de Louis-Marie Houdebine, et plus récemment celles
de BioProtein Technologies ont concentré leur
activité sur la génération de lignées
de lapines transgéniques exprimant des protéines
recombinantes et des vaccins dans leur lait. A ce jour,
une quinzaine de protéines différentes
ont été produites dans le lait d'animaux
transgéniques. D’excellents résultats
ont été obtenus avec divers types de protéines
dont :
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Des Hormones
Hormone de croissance humaine - active in
vitro.
Gonadotropine - active in vitro.
Des Virus-Like Particles du Rotavirus
(Rotavirus-VLP's)
Obtention d’animaux transgéniques
exprimant dans leur lait deux protéines
de capside virale.
L’injection du lactosérum provenant
de ce lait à des souris a induit la sécrétion
d’anticorps spécifiques dirigés
contre les protéines de capside virale.
Des Anticorps Monoclonaux
Production d’anticorps monoclonaux dans le
lait de lapines transgéniques. La glande
mammaire hypofucosyle naturellement les protéines
qu'elle secrète. Ainsi le lait de lapines
transgéniques peut offrir des avantages
en termes de production d'anticorps utilisant
un mécanisme d'action de type ADCC (Antibody
Dependant Cell Cytotoxicity)
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Comment
produire des protéines ou des vaccins recombinants
dans le lait de lapines transgéniques?
Parmi
toutes les protéines présentes dans le
lait, seul un nombre limité est effectivement
produit par les cellules de la glande mammaire. Ces
protéines peuvent être classées
en deux familles principales : les caséines et
les protéines du lactosérum ou petit lait
(whey proteins).
La
production d’une protéine dans le lait peut
être obtenue en transférant dans des embryons
de lapin un transgène associant le cDNA codant
la protéine d’intérêt et un
promoteur spécifique de la glande mammaire
(promoteur du gène WAP: Whey
Acidic Protein). D’autres éléments
régulateurs comme des amplificateurs et des isolateurs
sont associés et participent au contrôle
du taux d'expression du transgène.
BioProtein
Technologies possède des licences
exclusives de l’INRA, en particulier
sur le promoteur du gène WAP de lapin et sur
un isolateur. La société possède
également une connaissance très approfondie
des divers éléments composant la région
transcrite (introns, amplificateurs, terminateurs).
Ces
éléments clé permettent à
BioProtein Technologies de cibler efficacement et spécifiquement
la sécrétion de protéines recombinantes
dans le lait des lapines transgéniques.
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Comment
les animaux transgéniques sont-ils créés
?
Le
cDNA codant la protéine d’intérêt
est optimisé in silico, synthétise,
puis associé à des éléments
régulateurs de gènes exprimés spécifiquement
dans le lait (promoteur du gène WAP). Le vecteur
d’expression ainsi obtenu est micro-injecté
sous microscope dans des embryons de lapin au stade
unicellulaire. Les embryons sont ensuite transférés
dans des femelles receveuses.
Après un mois de gestation, les premiers lapins
ayant intégré le transgène dans
leur génome (F0 ou fondateurs génétiques)
naissent et sont identifiés par analyse
PCR à partir de biopsies d’oreille.
Ils serviront de fondateurs pour donner naissance à
la deuxième génération de lapins
transgéniques. Les fondateurs sont sélectionnés
pour leur efficacité à produire la protéine
d'intérêt dans leur lait et pour générer
la seconde génération de lapins transgéniques
(F1).
La descendance F1 est identifiée par biopsie
de l'oreille suivie d'analyse par PCR. Les femelles
F1 sexuellement matures sont inséminées
avec du sperme de mâle non transgénique
pour obtenir une descendance et du lait. Le lait
est récolté mécaniquement
et la protéine recombinante est caractérisée
afin de sélectionner la meilleure lignée
pour la production à grande échelle et
pour développer la stratégie de purification.
Afin de garantir la consistance et la pérénnité
de la production tout au long du cycle de vie du biomédicament,
des banques sont établies conformément
aux exigences réglementaires. Il s'agit de Master
Transgenic Bank (MTB) et de Working
Transgenic Bank (WTB).
Il
peut s'agir de sperme de mâles transgéniques
(Master/Working Sperm Bank - MSB/WSB)
qui est récolté et cryo-conservé
dans de l'azote liquide, et/ou de banques d'embryons
congelés issues du croisement de mâles
transgéniques (Master/Working
Embryo Bank - MEB/WEB) comme l'exigent
les recommandations de la FDA
et de l'EMEA.
A titre d'exemple le sperme d'un mâle
transgénique F1 bien caractérisé
pourra servir à constituer une MSB
et sera utilisé pour inséminer artificiellement
des femelles non-transgéniques qui généreront
des mâles transgéniques F2 en plus grand
nombre. Le sperme de mâles transgéniques
F2 est récolté
et servira à préparer la MSB.
Pendant
toute la durée de vie du médicament,,
les WSB ou WEB serviront à générer
des mâles transgéniques reproducteurs qui
auront pour mission de constituer le cheptel industriel
de lapines lactantes produisant la protéine
recombinante d'intérêt
dans leur lait.
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Dans
quels délais les protéines / vaccins recombinants
sont-ils produits ?
Les
protéines ou les vaccins recombinants sont secrétés
dans le lait des lapines transgéniques pendant
la lactation. La traite peut commencer dès la
mise bas des femelles transgéniques. En règle
générale, suffisamment de lait peut être
collecté à partir des animaux fondateurs
pour pouvoir déterminer la concentration de la
protéine dans le lait, commencer la caractérisation
de la protéine et mettre en place les procédures
de purification.
Des quantités importantes de lait permettant
la préparation de lots précliniques peuvent
être collectées à partir des premiers
animaux F1.
La
durée
séparant l’étape de micro-injection
du transgène dans les embryons de la
première lactation
des femelles fondatrices est de 6
mois. En parallèle, les mâles
fondateurs sont croisés avec des femelles non-transgéniques
pour donner naissance à la deuxième génération
de lapines transgéniques qui permettra une rapide
montée en puissance industrielle. Le délai
nécessaire pour pouvoir commencer la traite des
lapins de deuxième génération est
d’approximativement 12 mois après les premières
micro-injections.
--> En savoir
plus …
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FOIRE AUX QUESTIONS ::::: 
