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Qu'est
ce qu'un animal transgénique ?
Un animal transgénique est un animal porteur
d'ADN exogène (un ou plusieurs gènes)
intégré dans son propre génome.
Dans le cadre de la production de protéines ou
de vaccins recombinants utilisés en santé
humaine, cet ADN code une protéine hétérologue
d'intérêt thérapeutique (anticorps,
hormone, protéine de capside virale...), qui
est secrétée dans le lait des animaux
transgéniques puis purifiée.
Les animaux transgéniques sont devenus aujourd'hui
un système de production efficace pour fournir
de grandes quantités de
protéines
thérapeutiques ou
de vaccins recombinants,
à des coûts très compétitifs.
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Pourquoi
choisir le lait d'animaux transgéniques pour
produire des protéines ou des vaccins recombinants
?
La glande mammaire est un organe qui produit naturellement
de grandes quantités de glycoprotéines
complexes (en moyenne 140 g de protéines totales
par litre de lait pour le lapin). Ces protéines
assurent principalement un rôle nutritif pour
les nouveaux nés.
Les cellules épithéliales de la glande
mammaire possèdent la machinerie cellulaire nécessaire
à la synthèse, au repliement et à
l'assemblage de glycoprotéines complexes. Elles
peuvent notamment réaliser des modifications
post-traductionnelles telles que les glycosylations
ou les gamma-carboxylations.
Pour de nombreuses protéines
recombinantes d'origine humaine, ces modifications post
traductionnelles sont indispensables pour garantir une
activité biologique et des caractéristiques
pharmacocinétiques appropriées.
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Quels
sont les avantages des systèmes d'expression
transgénique par rapport aux autres systèmes
?
Diverses
méthodes sont utilisées pour la production
industrielle de protéines:
Les systèmes bactériens
(E. Coli) sont très utilisés
et efficaces. Ils permettent de produire des protéines
à faible coût. Cependant, leur utilisation
est limitée à la production de protéines
simples, non glycosylées, qui ne requièrent
pas de processus élaboré de repliement.
Les systèmes fongiques permettent
de produire certaines protéines secrétées.
Néanmoins, ces systèmes apportent des
modifications post-traductionnelles qui affectent fortement
les propriétés pharmacocinétiques
des protéines produites (ajout de divers groupements
mannose).
Les systèmes utilisant des baculovirus
permettent de produire des protéines
très variées mais leur application à
l’échelle industrielle reste difficile.
La culture de cellules de mammifères
est le système standard de production de protéines
recombinantes complexes (telles que les anticorps monoclonaux).
Les systèmes d’expression cellulaire permettent
d’obtenir des protéines recombinantes correctement
repliées et modifiées. Cependant le faible
rendement par rapport au coût de production est
un sérieux désavantage.
Les systèmes utilisant des plantes transgéniques
permettent de produire des protéines en quantités
très importantes. Cependant, ces systèmes
apportent des modifications post-traductionnelles spécifiques
aux plantes (ajout de résidus xylose), fortement
immunogènes pour des patients humains.
Les
animaux transgéniques représentent
ainsi une excellente solution alternative pour produire
des vaccins recombinants ou des protéines thérapeutiques
complexes, correctement glycosylées et repliées.
Ils permettent en effet de combiner à la fois
les niveaux d’expression rencontrés
dans les systèmes bactériens et les modifications
post-traductionnelles obtenues en culture
cellulaire, tout en offrant des coûts de production
plus faibles que les systèmes d’expression
cellulaires.
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Pourquoi le lapin ?
Capacité de générer un grand nombre
de fondateurs grâce au faible coût par embryon.
Cela fournit à nos clients l'opportunité
d'augmenter significativement les chances d'obtenir
une ou plusieurs lignées de lapines transgéniques
produisant des quantités suffisante d'une protéine
biologiquement active.
Période de gestation courte et maturation sexuelle
rapide.
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En savoir plus…
Court délai de
mise sur le marché.
Faibles coûts de production : jusqu’à
50% d’économie en comparaison avec le système
de référence de l’industrie (cellules
CHO).
80% des protéines à usage thérapeutique
actuellement sur le marché ont des indications
qui nécessitent une production mondiale annuelle
inférieure à 10 Kg de protéines.
Dans ce contexte, le lapin
apparait comme un système particulièrement
adapté et
flexible.
Les lapins sont phylogéniquement plus
proches de l'homme que d'autres animaux
laitiers, ce qui en fait un modèle de choix pour
la production de protéines thérapeutiques
humaines ou de vaccins recombinants.
Adapté à la production de protéines
complexes et glycosylées.
Pas de maladie à
prion connue chez le lapin.
Pas de transmission de maladies virales sérieuse
à l’homme
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Quel
volume de lait et quelle quantité de protéines/vaccins
recombinants un lapin peut-t-il produire ?
Une femelle peut produire jusqu’à
250 ml de lait par
jour de lactation. Cependant,
seuls 100 à 150 ml de lait sont collectés
en routine par animal et par jour de lactation.
Le volume de lait collecté par femelle
atteint ainsi jusqu'à
15 litres par an.
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Davies
(1983) The composition of milk. Biochem. Lactation,T.B.Mepham.
Elsevier, 71-117.
Jenness (1982) Inter-species comparison of milk
proteins. Dev Diary Chemistry, 1:87-114. |
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La concentration en protéines recombinantes
présentes dans le lait est variable selon
la lignée de lapines transgéniques
obtenues. Elle est comprise en moyenne entre
1 à
10 g par litre.
Grâce
à sa plate-forme technologique, BioProtein
Technologies garantit une production
jusqu'à 10 kg
de protéines
ou de vaccins recombinants
par an (à partir d'un élevage
de quelques centaines de lapines en lactation).
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Comment
récupère-t-on le lait ?
Les lapines sont traites mécaniquement
dans une salle de traite confinée. Le lait
est directement filtré sur une membrane
0,22 µm, clarifié (lipides et caséines
sont retirés) et stocké dans des
poches plastiques stériles à -20°C
en conditions GMP
avant d'être traité par Eurogentec,
notre partenaire de purification.
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> More...
BioProtein Technologies a mis au point, en collaboration
avec l’INRA, une trayeuse automatique
qui permet de collecter efficacement le lait de
chaque lapine. Ces trayeuses sont en fonctionnement
depuis quelques années et ont d’ores
et déjà prouvé leur efficacité.
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Quels
types de composés biopharmaceutiques peut-on
produire ?
- Protéines Plasmatiques
- Anticorps Monoclonaux
- Hormones
-
Peptides
- Vaccins VLP multivalents
Depuis
une quinzaine d'années, les équipes INRA
de Louis-Marie Houdebine, et plus récemment celles
de BioProtein Technologies ont concentré leur
activité sur la génération de lignées
de lapines transgéniques exprimant des protéines
recombinantes et des vaccins (basés sur l'utilisation
de Virus-Like Particles de Rotavirus) dans leur lait.
A ce jour, une quinzaine de protéines différentes
ont été produites dans le lait d'animaux
transgéniques. D’excellents résultats
ont été obtenus avec divers types de protéines
dont :
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Des Hormones
Hormone de croissance humaine - active in
vitro.
Gonadotropine - active in vitro.
Des Virus-Like Particles du Rotavirus
(Rotavirus-VLP's)
Obtention d’animaux transgéniques
exprimant dans leur lait deux protéines
de capside virale.
L’injection du lactosérum provenant
de ce lait à des souris a induit la sécrétion
d’anticorps spécifiques dirigés
contre les protéines de capside virale.
Des Anticorps Monoclonaux
Chimérisation de deux anticorps murins.
Production d’un anticorps monoclonal chimérique
dans le lait d’animaux transgéniques.
Production d’anticorps monoclonaux dans le
lait de lapines transgéniques.
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Comment
produire des protéines ou des vaccins recombinants
dans le lait de lapines transgéniques?
Parmi toutes les protéines présentes dans
le lait, seul un nombre limité est effectivement
produit par les cellules de la glande mammaire. Ces
protéines peuvent être classées
en deux familles principales : les caséines et
les protéines du petit lait (Whey Proteins).
La production d’une protéine dans le lait
peut être obtenue en transférant chez le
lapin un transgène associant le gène codant
la protéine d’intérêt et un
promoteur spécifique de la glande mammaire
(promoteur du gène WAP: Whey
Acidic Protein). D’autres éléments
régulateurs comme des amplificateurs et des isolateurs
sont associés et participent au contrôle
du taux d'expression du gène.
BioProtein Technologies possède des licences
exclusives de l’INRA, en particulier
sur le promoteur du gène WAP de lapin et sur
un isolateur. La société possède
également une connaissance très approfondie
des divers éléments composant la région
transcrite (introns, amplificateurs, terminateurs).
Ces
éléments clé permettent à
BioProtein Technologies de cibler efficacement et spécifiquement
la sécrétion de protéines recombinantes
dans le lait des lapines transgéniques.
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Comment
les animaux transgéniques sont-ils créés
?
Le
gène codant la protéine d’intérêt
est associé à des éléments
régulateurs de gènes exprimés spécifiquement
dans le lait (Promoteur du gène WAP) par l’équipe
de biologie moléculaire. Le vecteur d’expression
ainsi obtenu est micro-injecté sous microscope
dans des embryons de lapin au stade unicellulaires.
Les embryons sont ensuite transférés dans
des femelles receveuses.
Après un mois de gestation, les premiers lapins
ayant intégré le transgène (F0)
dans leur génome naissent et sont identifiés
par analyse PCR de
biopsie d’oreille. Ils serviront de fondateurs
pour donner naissance à la deuxième génération
de lapins transgéniques. Les fondateurs sont
sélectionnés pour leur efficacité
à produire la protéine d'intérêt
dans leur lait et pour générer la seconde
génération de lapins transgéniques
(F1).
La descendance F1 est identifiée par biopsie
de l'oreille suivie d'analyse par PCR. Les femelles
F1 matures sexuellement sont alors inséminées
avec du sperme de mâle non transgénique.
Le lait est récolté
mécaniquement et la protéine
recombinante est caractérisée afin de
sélectionner la meilleure lignée pour
la production à grande échelle et pour
développer la stratégie de purification
(GLP, pré-GMP, GMP).
En parallèle, le sperme de mâles
transgéniques F1 - Master
Sperm Bank, MSB
- est récolté et cryo-conservé
dans de l'azote liquide, suivant les recommendations
de la FDA et des
instances européennes.
Ce sperme sera utilisé pour inséminer
artificiellement des femelles non-transgéniques
pour générer la seconde descendance (F2).
Le sperme de mâles transgéniques
F2 - Working SpermBank, WSB -
est recolté et servira, pendant 15-20 ans, à
la génération de femelles transgéniques
F3 qui produiront les quantités industrielles
de la protéine
recombinante d'intérêt
ou du vaccin
dans leur lait.
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Dans
quels délais les protéines / vaccins recombinants
sont-ils produits ?
Les
protéines ou les vaccins recombinants sont secrétés
dans le lait des lapines transgéniques pendant
la lactation. La traite peut commencer dès la
naissance des lapereaux. En règle générale,
suffisamment de lait peut être collecté
à partir des animaux fondateurs pour pouvoir
déterminer la concentration de la protéine
dans le lait, commencer la caractérisation de
la protéine, et mettre en place les procédures
de purification. Les quantités produites par
les fondateurs sont souvent suffisantes pour démarrer
les essais pré-cliniques.
La
durée
séparant l’étape de micro-injection
du transgène dans les embryons de la
première lactation
des femelles fondatrices est de 6
mois. En parallèle, les mâles
fondateurs sont croisés avec des femelles non-transgéniques
pour donner naissance à la deuxième génération
de lapines transgéniques qui permettra une rapide
montée en puissance industrielle. Le délai
nécessaire pour pouvoir commencer la traite des
lapins de deuxième génération est
d’approximativement 11 mois après les premières
micro-injections.
--> En savoir
plus …
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FOIRE AUX QUESTIONS ::::: 
